US 12,305,233 B1
Ultra-high-throughput assay for telomerase repeat addition processivity
Julian Chen, Chandler, AZ (US); and Yang Li, Chandler, AZ (US)
Assigned to Arizona Board of Regents on Behalf of Arizona, Scottsdale, AZ (US)
Filed by ARIZONA BOARD OF REGENTS ON BEHALF OF ARIZONA STATE UNIVERSITY, Scottsdale, AZ (US)
Filed on Jul. 9, 2021, as Appl. No. 17/372,255.
Claims priority of provisional application 63/050,095, filed on Jul. 9, 2020.
Int. Cl. C12Q 1/6876 (2018.01)
CPC C12Q 1/6876 (2013.01) 11 Claims
 
1. An ultra-high-throughput method for determining telomerase processivity, the method comprising:
a. incubating a telomerase, a telomeric DNA primer, and dNTPs comprising 5-100 μM dGTP under suitable conditions for telomerase activity, optionally in the presence of an agent, thereby forming telomerase-extended DNA products;
b. analyzing the telomerase-extended DNA products to determine the processivity of said telomerase;
c. ligating a hairpin adapter to the telomerase-extended DNA products produced in step (a) prior to step (b) to produce adapter-ligated DNA products; and
d. amplifying the adapter-ligated DNA products to produce a double-stranded DNA amplicon library, wherein step (b) comprises sequencing the double-stranded DNA amplicon library,
wherein;
the telomeric DNA primer comprises:
a part of a telomeric repeat or at least one telomeric repeat at the 3′ end of the telomeric DNA primer; and
a nucleotide barcode, wherein the nucleotide barcode is selected the group consisting of: ACCCTTG, GCCCTTT, GTGTTCG, TGGGTTT, CCCCTTG, GCCGCTT, GTGTTCT, TGGTCCG, CCCTTTT, GCCGTTT, GTGTTGC, TGGTCGT, CCGCTTG, GCCTCTT, GTGTTGT, TGGTCTG, CCGCTTT, GCCTGTT, GTGTTTG, TGGTCTT, CCGGCTT, GCCTTGG, GTGTTTT, TGGTGCT, CCGGTTG, GCCTTGT, GTTCCCT, TGGTGGT, CCGGTTT, GCCTTTG, GTTCCGG, TGGTGTG, CCGTCTT, GCCTTTT, GTTCCTC, TGGTTCG, CCGTTGT, GCGCCTT, GTTCCTG, TGGTTCT, CCGTTTT, GCGCGTT, GTTCGCG, TGGTTGG, CCTCCGT, GCGCTCT, GTTCGCT, TGGTTGT, CCTCCTT, GCGCTTG, GTTCGGT, TGGTTTC, CCTCGGT, GCGCTTT, GTTCGTC, TGGTTTT, CCTCGTG, GCGGCTT, GTTCGTG, TGTCCCG, CCTCTGT, GCGGGTT, GTTCGTT, TGTCCCT, CCTCTTG, GCGGTGT, GTTCTCT, TGTCCGG, CCTGCTT, GCGGTTT, GTTCTGC, TGTCCTG, CCTGTGT, GCGTCTG, GTTCTGT, TGTCCTT, CCTGTTG, GCGTCTT, GTTCTTC, TGTCGCG, CCTGTTT, GCGTGGT, GTTCTTG, TGTCGCT, CCTTCTG, GCGTGTT, GTTCTTT, TGTCGGT, CCTTGGT, GCGTTCG, GTTGCGG, TGTCGTT, CCTTGTG, GCGTTGT, GTTGCGT, TGTCTCG, CCTTTCG, GCGTTTC, GTTGCTC, TGTCTGG, CCTTTCT, GCGTTTG, GTTGCTG, TGTCTGT, CCTTTGG, GCGTTTT, GTTGGTC, TGTCTTG, CCTTTGT, GCTCCGT, GTTGGTG, TGTCTTT, CCTTTTG, GCTCCTT, GTTGGTT, TGTGCCT, CCTTTTT, GCTCGCT, GTTGTCG, TGTGCGG, CGCCCTT, GCTCGGT, GTTGTCT, TGTGCGT, CGCCGTT, GCTCGTC, GTTGTGC, TGTGCTC, CGCCTTG, GCTCGTG, GTTGTGG, TGTGCTG, CGCGCTT, GCTCGTT, GTTGTGT, TGTGCTT, CGCGGTT, GCTCTCG, GTTGTTC, TGTGGTG, CGCGTTG, GCTCTCT, GTTGTTG, TGTGGTT, CGCGTTT, GCTCTGG, GTTGTTT, TGTGTGC, CGCTCGT, GCTCTGT, GTTTCCG, TGTGTGG, CGCTCTT, GCTCTTC, GTTTCGT, TGTGTGT, CGCTTCT, GCTCTTG, GTTTCTC, TGTGTTC, CGCTTGT, GCTCTTT, GTTTCTG, TGTGTTG, CGCTTTG, GCTGCTG, GTTTCTT, TGTTCCG, CGCTTTT, GCTGCTT, GTTTGCG, TGTTCCT, CGGCCTT, GCTGGGT, GTTTGCT, TGTTCGC, CGGCGTT, GCTGGTT, GTTTGGC, TGTTCGT, CGGCTTT, GCTGTGT, GTTTGGG, TGTTCTG, CGGGCTT, GCTGTTT, GTTTGGT, TGTTCTT, CGGGTCT, GCTTCCG, GTTTGTC, TGTTGCG, CGGGTTG, GCTTCCT, GTTTGTG, TGTTGGG, CGGGTTT, GCTTCTT, GTTTTCC, TGTTGGT, CGGTCGT, GCTTGCT, GTTTTCG, TGTTGTC, CGGTCTG, GCTTGGT, GTTTTGC, TGTTGTG, CGGTCTT, GCTTGTC, GTTTTGG, TGTTTCG, CGGTGTG, GCTTGTG, GTTTTGT, TGTTTGG, CGGTGTT, GCTTGTT, GTTTTTG, TGTTTGT, CGGTTCG, GCTTTCG, GTTTTTT, TGTTTTG, CGGTTCT, GCTTTGC, TCCCCGG, TTCCCCG, CGGTTGT, GCTTTGT, TCCCCGT, TTCCCGT, CGGTTTT, GCTTTTC, TCCCCTG, TTCCCTG, CGTCCGT, GCTTTTG, TCCCCTT, TTCCCTT, CGTCCTT, GCTTTTT, TCCCGTT, TTCCGCG, CGTCGCT, GGCCCTT, TCCCTTG, TTCCGGG, CGTCGGT, GGCCGTT, TCCCTTT, TTCCGGT, CGTCGTG, GGCCTTT, TCCGCGT, TTCCGTG, CGTCGTT, GGCGCTT, TCCGCTG, TTCCTCG, CGTCTCG, GGCGGTT, TCCGGTG, TTCCTGT, CGTCTTT, GGCGTTT, TCCGGTT, TTCCTTG, CGTGCGT, GGCTCGT, TCCGTCT, TTCCTTT, CGTGCTT, GGCTCTC, TCCGTGT, TTCGCCG, CGTGGGT, GGCTCTT, TCCGTTG, TTCGCCT, CGTGGTG, GGCTGGT, TCCTCGG, TTCGCTC, CGTGTCT, GGCTGTT, TCCTCGT, TTCGCTG, CGTGTGG, GGCTTCG, TCCTCTT, TTCGCTT, CGTGTGT, GGCTTCT, TCCTGTT, TTCGGCT, CGTGTTG, GGCTTGC, TCCTTGG, TTCGGTG, CGTGTTT, GGCTTGG, TCCTTGT, TTCGGTT, CGTTCCT, GGCTTGT, TCCTTTG, TTCGTCG, CGTTCGT, GGCTTTC, TCCTTTT, TTCGTCT, CGTTCTG, GGCTTTG, TCGCCCT, TTCGTGG, CGTTCTT, GGGCTTT, TCGCCTT, TTCGTGT, CGTTGCG, GGGGTCT, TCGCGCT, TTCGTTC, CGTTGGG, GGGGTTG, TCGCGGT, TTCGTTG, CGTTGGT, GGGGTTT, TCGCGTG, TTCGTTT, CGTTGTG, GGGTCTT, TCGCGTT, TTCTCCG, CGTTGTT, GGGTGTT, TCGCTCG, TTCTCCT, CGTTTCG, GGGTTGT, TCGCTCT, TTCTCGG, CGTTTCT, GGGTTTT, TCGCTTG, TTCTCGT, CGTTTGC, GGTCCCT, TCGCTTT, TTCTCTC, CGTTTGG, GGTCCGT, TCGGCGT, TTCTCTG, CGTTTGT, GGTCCTC, TCGGCTT, TTCTCTT, CGTTTTC, GGTCCTG, TCGGTCT, TTCTGCT, CGTTTTG, GGTCCTT, TCGGTTC, TTCTGGG, CGTTTTT, GGTCGCT, TCGGTTG, TTCTGGT, CTCCCTT, GGTCGTC, TCGGTTT, TTCTGTG, CTCCGCT, GGTCGTT, TCGTCCG, TTCTTGC, CTCCGGT, GGTCTCC, TCGTCGT, TTCTTGG, CTCCGTG, GGTCTCT, TCGTCTG, TTCTTTG, CTCCGTT, GGTCTGT, TCGTCTT, TTCTTTT, CTCCTCG, GGTCTTC, TCGTGGG, TTGCCCG, CTCCTTG, GGTCTTG, TCGTGGT, TTGCCGT, CTCCTTT, GGTCTTT, TCGTGTG, TTGCCTG, CTCGCGT, GGTGCGT, TCGTGTT, TTGCCTT, CTCGCTG, GGTGCTC, TCGTTCG, TTGCGCG, CTCGCTT, GGTGCTT, TCGTTGG, TTGCGCT, CTCGGGT, GGTGGCT, TCGTTGT, TTGCGGG, CTCGTCT, GGTGTCT, TCGTTTG, TTGCGGT, CTCGTGG, GGTGTGT, TCGTTTT, TTGCGTG, CTCGTGT, GGTGTTG, TCTCCCG, TTGCTCT, CTCGTTG, GGTGTTT, TCTCCGG, TTGCTGT, CTCGTTT, GGTTCCG, TCTCCGT, TTGCTTC, CTCTCGG, GGTTCCT, TCTCCTG, TTGCTTG, CTCTCGT, GGTTCGC, TCTCCTT, TTGCTTT, CTCTCTG, GGTTCGG, TCTCGCT, TTGGCCG, CTCTCTT, GGTTCTC, TCTCGGT, TTGGCCT, CTCTTCG, GGTTCTG, TCTCGTC, TTGGCGT, CTCTTCT, GGTTGCT, TCTCGTG, TTGGCTT, CTCTTGG, GGTTGGG, TCTCGTT, TTGGGCT, CTCTTGT, GGTTGTC, TCTCTCT, TTGGGTT, CTCTTTG, GGTTGTG, TCTCTGG, TTGGTGG, CTCTTTT, GGTTGTT, TCTCTGT, TTGGTGT, CTGCCGT, GGTTTCC, TCTCTTG, TTGGTTC, CTGCGGT, GGTTTCG, TCTCTTT, TTGGTTG, CTGCGTG, GGTTTCT, TCTGCCT, TTGGTTT, CTGCGTT, GGTTTGG, TCTGCGT, TTGTCCG, CTGCTCT, GGTTTGT, TCTGCTG, TTGTCCT, CTGCTTG, GGTTTTC, TCTGCTT, TTGTCGT, CTGCTTT, GGTTTTG, TCTGGTG, TTGTCTC, CTGGCGT, GGTTTTT, TCTGGTT, TTGTCTG, CTGGGTG, GTCCCCT, TCTGTCT, TTGTCTT, CTGGGTT, GTCCCGT, TCTGTGG, TTGTGCG, CTGGTCT, GTCCCTT, TCTGTGT, TTGTGCT, CTGGTGT, GTCCGGT, TCTGTTG, TTGTGGG, CTGGTTG, GTCCGTG, TCTGTTT, TTGTGGT, CTGGTTT, GTCCGTT, TCTTCGG, TTGTGTC, CTGTCCG, GTCCTCG, TCTTCTG, TTGTGTG, CTGTCCT, GTCCTCT, TCTTCTT, TTGTGTT, CTGTCGG, GTCCTGT, TCTTGCG, TTGTTCG, CTGTCTG, GTCCTTC, TCTTGCT, TTGTTGC, CTGTCTT, GTCCTTG, TCTTGGG, TTGTTGT, CTGTGCT, GTCCTTT, TCTTGGT, TTGTTTT, CTGTGGT, GTCGCGT, TCTTGTT, TTTCCCG, CTGTGTT, GTCGCTG, TCTTTCG, TTTCCCT, CTGTTCG, GTCGCTT, TCTTTGG, TTTCCGC, CTGTTGG, GTCGGCT, TCTTTGT, TTTCCGG, CTGTTGT, GTCGGTG, TCTTTTG, TTTCCTG, CTGTTTC, GTCGGTT, TGCCCCT, TTTCCTT, CTGTTTG, GTCGTCT, TGCCCGT, TTTCGCG, CTTCCCT, GTCGTGT, TGCCCTT, TTTCGCT, CTTCCGT, GTCGTTG, TGCCGCT, TTTCGGC, CTTCCTT, GTCGTTT, TGCCGTG, TTTCGGG, CTTCGCG, GTCTCCG, TGCCTGT, TTTCGGT, CTTCGGG, GTCTCCT, TGCGCGT, TTTCGTC, CTTCGGT, GTCTCGC, TGCGCTG, TTTCGTT, CTTCGTG, GTCTCGG, TGCGCTT, TTTCTCT, CTTCGTT, GTCTCGT, TGCGGGT, TTTCTGC, CTTCTCG, GTCTCTC, TGCGGTT, TTTCTGG, CTTCTGG, GTCTCTG, TGCGTCT, TTTCTTG, CTTCTGT, GTCTCTT, TGCGTGG, TTTGCCG, CTTCTTC, GTCTGCT, TGCGTGT, TTTGCCT, CTTCTTG, GTCTGGT, TGCGTTG, TTTGCGC, CTTCTTT, GTCTGTT, TGCGTTT, TTTGCGG, CTTGCCT, GTCTTGC, TGCTCCG, TTTGCGT, CTTGCTG, GTCTTGT, TGCTCGC, TTTGCTC, CTTGCTT, GTCTTTC, TGCTCGG, TTTGCTG, CTTGGCT, GTCTTTG, TGCTCGT, TTTGCTT, CTTGGGT, GTCTTTT, TGCTCTG, TTTGGCG, CTTGGTT, GTGCCCT, TGCTCTT, TTTGGGT, CTTGTCG, GTGCCTT, TGCTGCT, TTTGGTG, CTTGTCT, GTGCGCT, TGCTGGT, TTTGGTT, CTTGTGG, GTGCGGT, TGCTGTG, TTTGTCG, CTTGTGT, GTGCGTT, TGCTGTT, TTTGTCT, CTTGTTG, GTGCTCG, TGCTTCG, TTTGTGG, CTTGTTT, GTGCTCT, TGCTTGC, TTTGTGT, CTTTCCG, GTGCTGT, TGCTTGG, TTTGTTG, CTTTCGG, GTGCTTC, TGCTTTC, TTTTCCG, CTTTCGT, GTGCTTG, TGGCCTT, TTTTCCT, CTTTCTC, GTGGGTC, TGGCGCT, TTTTCGC, CTTTCTG, GTGGTCG, TGGCGGT, TTTTCGG, CTTTCTT, GTGGTCT, TGGCGTT, TTTTCGT, CTTTGCG, GTGGTTC, TGGCTCG, TTTTCTG, CTTTGCT, GTGGTTG, TGGCTTC, TTTTCTT, CTTTGGT, GTGTCCG, TGGCTTG, TTTTGCG, CTTTGTG, GTGTCCT, TGGCTTT, TTTTGCT, CTTTGTT, GTGTCGG, TGGGCCT, TTTTGGC, CTTTTCG, GTGTCGT, TGGGCTG, TTTTGGG, CTTTTGC, GTGTCTC, TGGGCTT, TTTTGGT, CTTTTGG, GTGTCTG, TGGGGCT, TTTTGTG, CTTTTGT, GTGTCTT, TGGGGTT, TTTTTCG, CTTTTTG, GTGTGCT, TGGGTCT, TTTTTGC, CTTTTTT, GTGTGGT, TGGGTGT, TTTTTGG, GCCCGTT, GTGTGTC, TGGGTTC, TTTTTGT, GCCCTGT, GTGTGTT, TGGGTTG, and TTTTTTG; and
the hairpin adapter specifically binds to the telomerase-extended DNA products but does not bind to the telomeric DNA primer, and wherein the hairpin adapter comprises:
a sequence that is complementary to the 3′ end of the telomerase-extended DNA products;
a 5′ phosphate to allow for ligation with the telomerase-extended DNA products;
a purification moiety;
a PCR primer binding site;
a stem-loop structure comprising a double-stranded stem and a single-stranded loop; and
a single-stranded 3′-overhang,
wherein the PCR primer binding site is contained within the single-stranded loop, and wherein the sequence that is complementary to the 3′ end of the telomerase-extended DNA products is located within the single-stranded 3′-overhang.