| CPC C12Q 1/6876 (2013.01) | 11 Claims |
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1. An ultra-high-throughput method for determining telomerase processivity, the method comprising:
a. incubating a telomerase, a telomeric DNA primer, and dNTPs comprising 5-100 μM dGTP under suitable conditions for telomerase activity, optionally in the presence of an agent, thereby forming telomerase-extended DNA products;
b. analyzing the telomerase-extended DNA products to determine the processivity of said telomerase;
c. ligating a hairpin adapter to the telomerase-extended DNA products produced in step (a) prior to step (b) to produce adapter-ligated DNA products; and
d. amplifying the adapter-ligated DNA products to produce a double-stranded DNA amplicon library, wherein step (b) comprises sequencing the double-stranded DNA amplicon library,
wherein;
the telomeric DNA primer comprises:
a part of a telomeric repeat or at least one telomeric repeat at the 3′ end of the telomeric DNA primer; and
a nucleotide barcode, wherein the nucleotide barcode is selected the group consisting of: ACCCTTG, GCCCTTT, GTGTTCG, TGGGTTT, CCCCTTG, GCCGCTT, GTGTTCT, TGGTCCG, CCCTTTT, GCCGTTT, GTGTTGC, TGGTCGT, CCGCTTG, GCCTCTT, GTGTTGT, TGGTCTG, CCGCTTT, GCCTGTT, GTGTTTG, TGGTCTT, CCGGCTT, GCCTTGG, GTGTTTT, TGGTGCT, CCGGTTG, GCCTTGT, GTTCCCT, TGGTGGT, CCGGTTT, GCCTTTG, GTTCCGG, TGGTGTG, CCGTCTT, GCCTTTT, GTTCCTC, TGGTTCG, CCGTTGT, GCGCCTT, GTTCCTG, TGGTTCT, CCGTTTT, GCGCGTT, GTTCGCG, TGGTTGG, CCTCCGT, GCGCTCT, GTTCGCT, TGGTTGT, CCTCCTT, GCGCTTG, GTTCGGT, TGGTTTC, CCTCGGT, GCGCTTT, GTTCGTC, TGGTTTT, CCTCGTG, GCGGCTT, GTTCGTG, TGTCCCG, CCTCTGT, GCGGGTT, GTTCGTT, TGTCCCT, CCTCTTG, GCGGTGT, GTTCTCT, TGTCCGG, CCTGCTT, GCGGTTT, GTTCTGC, TGTCCTG, CCTGTGT, GCGTCTG, GTTCTGT, TGTCCTT, CCTGTTG, GCGTCTT, GTTCTTC, TGTCGCG, CCTGTTT, GCGTGGT, GTTCTTG, TGTCGCT, CCTTCTG, GCGTGTT, GTTCTTT, TGTCGGT, CCTTGGT, GCGTTCG, GTTGCGG, TGTCGTT, CCTTGTG, GCGTTGT, GTTGCGT, TGTCTCG, CCTTTCG, GCGTTTC, GTTGCTC, TGTCTGG, CCTTTCT, GCGTTTG, GTTGCTG, TGTCTGT, CCTTTGG, GCGTTTT, GTTGGTC, TGTCTTG, CCTTTGT, GCTCCGT, GTTGGTG, TGTCTTT, CCTTTTG, GCTCCTT, GTTGGTT, TGTGCCT, CCTTTTT, GCTCGCT, GTTGTCG, TGTGCGG, CGCCCTT, GCTCGGT, GTTGTCT, TGTGCGT, CGCCGTT, GCTCGTC, GTTGTGC, TGTGCTC, CGCCTTG, GCTCGTG, GTTGTGG, TGTGCTG, CGCGCTT, GCTCGTT, GTTGTGT, TGTGCTT, CGCGGTT, GCTCTCG, GTTGTTC, TGTGGTG, CGCGTTG, GCTCTCT, GTTGTTG, TGTGGTT, CGCGTTT, GCTCTGG, GTTGTTT, TGTGTGC, CGCTCGT, GCTCTGT, GTTTCCG, TGTGTGG, CGCTCTT, GCTCTTC, GTTTCGT, TGTGTGT, CGCTTCT, GCTCTTG, GTTTCTC, TGTGTTC, CGCTTGT, GCTCTTT, GTTTCTG, TGTGTTG, CGCTTTG, GCTGCTG, GTTTCTT, TGTTCCG, CGCTTTT, GCTGCTT, GTTTGCG, TGTTCCT, CGGCCTT, GCTGGGT, GTTTGCT, TGTTCGC, CGGCGTT, GCTGGTT, GTTTGGC, TGTTCGT, CGGCTTT, GCTGTGT, GTTTGGG, TGTTCTG, CGGGCTT, GCTGTTT, GTTTGGT, TGTTCTT, CGGGTCT, GCTTCCG, GTTTGTC, TGTTGCG, CGGGTTG, GCTTCCT, GTTTGTG, TGTTGGG, CGGGTTT, GCTTCTT, GTTTTCC, TGTTGGT, CGGTCGT, GCTTGCT, GTTTTCG, TGTTGTC, CGGTCTG, GCTTGGT, GTTTTGC, TGTTGTG, CGGTCTT, GCTTGTC, GTTTTGG, TGTTTCG, CGGTGTG, GCTTGTG, GTTTTGT, TGTTTGG, CGGTGTT, GCTTGTT, GTTTTTG, TGTTTGT, CGGTTCG, GCTTTCG, GTTTTTT, TGTTTTG, CGGTTCT, GCTTTGC, TCCCCGG, TTCCCCG, CGGTTGT, GCTTTGT, TCCCCGT, TTCCCGT, CGGTTTT, GCTTTTC, TCCCCTG, TTCCCTG, CGTCCGT, GCTTTTG, TCCCCTT, TTCCCTT, CGTCCTT, GCTTTTT, TCCCGTT, TTCCGCG, CGTCGCT, GGCCCTT, TCCCTTG, TTCCGGG, CGTCGGT, GGCCGTT, TCCCTTT, TTCCGGT, CGTCGTG, GGCCTTT, TCCGCGT, TTCCGTG, CGTCGTT, GGCGCTT, TCCGCTG, TTCCTCG, CGTCTCG, GGCGGTT, TCCGGTG, TTCCTGT, CGTCTTT, GGCGTTT, TCCGGTT, TTCCTTG, CGTGCGT, GGCTCGT, TCCGTCT, TTCCTTT, CGTGCTT, GGCTCTC, TCCGTGT, TTCGCCG, CGTGGGT, GGCTCTT, TCCGTTG, TTCGCCT, CGTGGTG, GGCTGGT, TCCTCGG, TTCGCTC, CGTGTCT, GGCTGTT, TCCTCGT, TTCGCTG, CGTGTGG, GGCTTCG, TCCTCTT, TTCGCTT, CGTGTGT, GGCTTCT, TCCTGTT, TTCGGCT, CGTGTTG, GGCTTGC, TCCTTGG, TTCGGTG, CGTGTTT, GGCTTGG, TCCTTGT, TTCGGTT, CGTTCCT, GGCTTGT, TCCTTTG, TTCGTCG, CGTTCGT, GGCTTTC, TCCTTTT, TTCGTCT, CGTTCTG, GGCTTTG, TCGCCCT, TTCGTGG, CGTTCTT, GGGCTTT, TCGCCTT, TTCGTGT, CGTTGCG, GGGGTCT, TCGCGCT, TTCGTTC, CGTTGGG, GGGGTTG, TCGCGGT, TTCGTTG, CGTTGGT, GGGGTTT, TCGCGTG, TTCGTTT, CGTTGTG, GGGTCTT, TCGCGTT, TTCTCCG, CGTTGTT, GGGTGTT, TCGCTCG, TTCTCCT, CGTTTCG, GGGTTGT, TCGCTCT, TTCTCGG, CGTTTCT, GGGTTTT, TCGCTTG, TTCTCGT, CGTTTGC, GGTCCCT, TCGCTTT, TTCTCTC, CGTTTGG, GGTCCGT, TCGGCGT, TTCTCTG, CGTTTGT, GGTCCTC, TCGGCTT, TTCTCTT, CGTTTTC, GGTCCTG, TCGGTCT, TTCTGCT, CGTTTTG, GGTCCTT, TCGGTTC, TTCTGGG, CGTTTTT, GGTCGCT, TCGGTTG, TTCTGGT, CTCCCTT, GGTCGTC, TCGGTTT, TTCTGTG, CTCCGCT, GGTCGTT, TCGTCCG, TTCTTGC, CTCCGGT, GGTCTCC, TCGTCGT, TTCTTGG, CTCCGTG, GGTCTCT, TCGTCTG, TTCTTTG, CTCCGTT, GGTCTGT, TCGTCTT, TTCTTTT, CTCCTCG, GGTCTTC, TCGTGGG, TTGCCCG, CTCCTTG, GGTCTTG, TCGTGGT, TTGCCGT, CTCCTTT, GGTCTTT, TCGTGTG, TTGCCTG, CTCGCGT, GGTGCGT, TCGTGTT, TTGCCTT, CTCGCTG, GGTGCTC, TCGTTCG, TTGCGCG, CTCGCTT, GGTGCTT, TCGTTGG, TTGCGCT, CTCGGGT, GGTGGCT, TCGTTGT, TTGCGGG, CTCGTCT, GGTGTCT, TCGTTTG, TTGCGGT, CTCGTGG, GGTGTGT, TCGTTTT, TTGCGTG, CTCGTGT, GGTGTTG, TCTCCCG, TTGCTCT, CTCGTTG, GGTGTTT, TCTCCGG, TTGCTGT, CTCGTTT, GGTTCCG, TCTCCGT, TTGCTTC, CTCTCGG, GGTTCCT, TCTCCTG, TTGCTTG, CTCTCGT, GGTTCGC, TCTCCTT, TTGCTTT, CTCTCTG, GGTTCGG, TCTCGCT, TTGGCCG, CTCTCTT, GGTTCTC, TCTCGGT, TTGGCCT, CTCTTCG, GGTTCTG, TCTCGTC, TTGGCGT, CTCTTCT, GGTTGCT, TCTCGTG, TTGGCTT, CTCTTGG, GGTTGGG, TCTCGTT, TTGGGCT, CTCTTGT, GGTTGTC, TCTCTCT, TTGGGTT, CTCTTTG, GGTTGTG, TCTCTGG, TTGGTGG, CTCTTTT, GGTTGTT, TCTCTGT, TTGGTGT, CTGCCGT, GGTTTCC, TCTCTTG, TTGGTTC, CTGCGGT, GGTTTCG, TCTCTTT, TTGGTTG, CTGCGTG, GGTTTCT, TCTGCCT, TTGGTTT, CTGCGTT, GGTTTGG, TCTGCGT, TTGTCCG, CTGCTCT, GGTTTGT, TCTGCTG, TTGTCCT, CTGCTTG, GGTTTTC, TCTGCTT, TTGTCGT, CTGCTTT, GGTTTTG, TCTGGTG, TTGTCTC, CTGGCGT, GGTTTTT, TCTGGTT, TTGTCTG, CTGGGTG, GTCCCCT, TCTGTCT, TTGTCTT, CTGGGTT, GTCCCGT, TCTGTGG, TTGTGCG, CTGGTCT, GTCCCTT, TCTGTGT, TTGTGCT, CTGGTGT, GTCCGGT, TCTGTTG, TTGTGGG, CTGGTTG, GTCCGTG, TCTGTTT, TTGTGGT, CTGGTTT, GTCCGTT, TCTTCGG, TTGTGTC, CTGTCCG, GTCCTCG, TCTTCTG, TTGTGTG, CTGTCCT, GTCCTCT, TCTTCTT, TTGTGTT, CTGTCGG, GTCCTGT, TCTTGCG, TTGTTCG, CTGTCTG, GTCCTTC, TCTTGCT, TTGTTGC, CTGTCTT, GTCCTTG, TCTTGGG, TTGTTGT, CTGTGCT, GTCCTTT, TCTTGGT, TTGTTTT, CTGTGGT, GTCGCGT, TCTTGTT, TTTCCCG, CTGTGTT, GTCGCTG, TCTTTCG, TTTCCCT, CTGTTCG, GTCGCTT, TCTTTGG, TTTCCGC, CTGTTGG, GTCGGCT, TCTTTGT, TTTCCGG, CTGTTGT, GTCGGTG, TCTTTTG, TTTCCTG, CTGTTTC, GTCGGTT, TGCCCCT, TTTCCTT, CTGTTTG, GTCGTCT, TGCCCGT, TTTCGCG, CTTCCCT, GTCGTGT, TGCCCTT, TTTCGCT, CTTCCGT, GTCGTTG, TGCCGCT, TTTCGGC, CTTCCTT, GTCGTTT, TGCCGTG, TTTCGGG, CTTCGCG, GTCTCCG, TGCCTGT, TTTCGGT, CTTCGGG, GTCTCCT, TGCGCGT, TTTCGTC, CTTCGGT, GTCTCGC, TGCGCTG, TTTCGTT, CTTCGTG, GTCTCGG, TGCGCTT, TTTCTCT, CTTCGTT, GTCTCGT, TGCGGGT, TTTCTGC, CTTCTCG, GTCTCTC, TGCGGTT, TTTCTGG, CTTCTGG, GTCTCTG, TGCGTCT, TTTCTTG, CTTCTGT, GTCTCTT, TGCGTGG, TTTGCCG, CTTCTTC, GTCTGCT, TGCGTGT, TTTGCCT, CTTCTTG, GTCTGGT, TGCGTTG, TTTGCGC, CTTCTTT, GTCTGTT, TGCGTTT, TTTGCGG, CTTGCCT, GTCTTGC, TGCTCCG, TTTGCGT, CTTGCTG, GTCTTGT, TGCTCGC, TTTGCTC, CTTGCTT, GTCTTTC, TGCTCGG, TTTGCTG, CTTGGCT, GTCTTTG, TGCTCGT, TTTGCTT, CTTGGGT, GTCTTTT, TGCTCTG, TTTGGCG, CTTGGTT, GTGCCCT, TGCTCTT, TTTGGGT, CTTGTCG, GTGCCTT, TGCTGCT, TTTGGTG, CTTGTCT, GTGCGCT, TGCTGGT, TTTGGTT, CTTGTGG, GTGCGGT, TGCTGTG, TTTGTCG, CTTGTGT, GTGCGTT, TGCTGTT, TTTGTCT, CTTGTTG, GTGCTCG, TGCTTCG, TTTGTGG, CTTGTTT, GTGCTCT, TGCTTGC, TTTGTGT, CTTTCCG, GTGCTGT, TGCTTGG, TTTGTTG, CTTTCGG, GTGCTTC, TGCTTTC, TTTTCCG, CTTTCGT, GTGCTTG, TGGCCTT, TTTTCCT, CTTTCTC, GTGGGTC, TGGCGCT, TTTTCGC, CTTTCTG, GTGGTCG, TGGCGGT, TTTTCGG, CTTTCTT, GTGGTCT, TGGCGTT, TTTTCGT, CTTTGCG, GTGGTTC, TGGCTCG, TTTTCTG, CTTTGCT, GTGGTTG, TGGCTTC, TTTTCTT, CTTTGGT, GTGTCCG, TGGCTTG, TTTTGCG, CTTTGTG, GTGTCCT, TGGCTTT, TTTTGCT, CTTTGTT, GTGTCGG, TGGGCCT, TTTTGGC, CTTTTCG, GTGTCGT, TGGGCTG, TTTTGGG, CTTTTGC, GTGTCTC, TGGGCTT, TTTTGGT, CTTTTGG, GTGTCTG, TGGGGCT, TTTTGTG, CTTTTGT, GTGTCTT, TGGGGTT, TTTTTCG, CTTTTTG, GTGTGCT, TGGGTCT, TTTTTGC, CTTTTTT, GTGTGGT, TGGGTGT, TTTTTGG, GCCCGTT, GTGTGTC, TGGGTTC, TTTTTGT, GCCCTGT, GTGTGTT, TGGGTTG, and TTTTTTG; and
the hairpin adapter specifically binds to the telomerase-extended DNA products but does not bind to the telomeric DNA primer, and wherein the hairpin adapter comprises:
a sequence that is complementary to the 3′ end of the telomerase-extended DNA products;
a 5′ phosphate to allow for ligation with the telomerase-extended DNA products;
a purification moiety;
a PCR primer binding site;
a stem-loop structure comprising a double-stranded stem and a single-stranded loop; and
a single-stranded 3′-overhang,
wherein the PCR primer binding site is contained within the single-stranded loop, and wherein the sequence that is complementary to the 3′ end of the telomerase-extended DNA products is located within the single-stranded 3′-overhang.
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